编者按：
测序技术使得我们对微生物组的深入分析成为可能。如今，研究人员们可以探索体内有哪些微生物，以及它们与疾病之间的潜在联系。但是这些信息还不足以揭示微生物与疾病之间互作的具体机制并提供合适干预手段，我们需要对微生物的功能、产物有更加深入的了解。
那么，究竟该如何进一步挖掘微生物组呢？
今天，我们特别编译 Nature 与 Illumina 共同发布的题为 How microbiome multi-omics can bolster human health 的文章。希望该文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发。
① 微生物组大数据
微生物组研究正在改变着我们人类对自身的看法。我们体内的微生物细胞数量至少与人体细胞数量相当，而这些微生物所拥有的基因种类更是超过了 100 万种。然而，我们对微生物基因组——“第二基因组”的大部分功能以及它如何影响健康，还知之甚少。
“肠道菌群就像是人类的一个百搭器官，”来自位于圣地亚哥的 illumina 公司测序技术研发部的副总裁 Gary Schroth 说，“每个人都拥有不同的肠道菌群，它们对我们消化食物和代谢药物的方式有巨大影响。”
大型合作项目，比如美国的人类微生物组计划（HMP）和欧洲的人类肠道宏基因组计划（MetaHIT），产生了大量的来自特定疾病患者或健康人群的肠道菌群的数据。这些项目不仅揭示了个体间微生物的多样性，同时还强调了需要进行更深入的微生物组分析，以了解微生物组的贡献。
肠道菌群的紊乱和许多疾病有关——不仅仅是那些影响消化系统的疾病（如炎症性肠病），遗传性免疫介导疾病（如哮喘）、神经系统性疾病（包括自闭症）以及基因驱动的疾病（如癌症）也都与肠道菌群的失调有关。因此，将微生物组研究成果转化为调控微生物组的治疗方法或可帮助我们控制这些常见疾病。
加州斯坦福大学的生理学家 Ami S. Bhatt 认为这是一个极具吸引力的机会。“几十年前，我们就已经知道人类特定的基因突变与某些疾病有关联，但是想要改变这些基因突变，真的很困难，”她说，“然而，现在我们发现微生物群落的组成也与疾病相关，并且，我们已经有了可以改变它们的有趣的工具”。
Bhatt 的研究主要集中在交流通讯方面，不仅是微生物和人类细胞之间的交流通讯，还包括微生物群落之间的交流通讯。
“我们试图了解究竟是什么微生物存在于那里，它们编码了什么样的产物，它们产生了什么样的交流信号以及这些信号是如何随着时间的变化而发生变化的。”她解释道。她的团队正在致力于研究如何操纵这些信号来促进人体健康和改善患者的病情。
② 挖掘微生物组的技术
几十年来，基于测序的细菌分析技术依赖于编码 16S 核糖体 RNA（rRNA）的基因。16S rRNA 基因由高度保守的核苷酸序列和具有属或种特异性的可变区域组成：研究人员们首先找到保守区域，然后扩增，再进一步分析散布的可变区域——将它们与参考序列进行比较注释，以确定当前所分析的细菌种类。
然而，因为 16S rRNA 测序仅仅是检测了每个微生物基因组中的单个基因，所以，其所提供的关于微生物群落的信息是非常有限的，且难以提供功能信息。而且该方法还低估了样本中微生物的多样性，因为我们很难区分亲缘关系相近的菌种，同时它还不能检测细菌以外的微生物，例如真菌和病毒，然而这些微生物为整个微生物组的功能都做出了贡献。
测序成本的下降和计算方法的改进，为鸟枪法基因组测序方法的普及奠定了基础。基于这项技术，研究人员们可以通过对提取的 DNA 片段进行测序，然后将它们与参考数据库进行比较，或者根据序列重叠区域的相似性对它们进行组装，从而分析样本的全基因组。
使用鸟枪法测序技术，研究人员可以识别基因或基因片段，并预测其编码蛋白质的功能。这是一项非常强大的技术，它提供了微生物组中潜在的功能信息，但由于序列的读取并不局限于单个的基因，如 16S rRNA 基因，这就导致这一方法需要更深的测序深度来达到与 16S 测序类似的检出率。因此，对于大规模研究来说，鸟枪法的费用就显得过于昂贵了。
尽管如此，研究人员还是越来越青睐鸟枪法测序。“与 16S rRNA 测序技术相比，鸟枪法提供了更多的信息。”Schroth 说。而且他还补充说，成本可以通过调整测序深度来控制。
不过，如果测序深度较浅，那么后续就需要依赖于微生物参考基因组来组装片段，因此会导致其应用的局限性。因为对于大多数微生物的来说，这些参考基因组的信息还不存在。
“在大部分情况下，我们的研究对象是缺少参考基因组的，因此我们无法将那些序列比对到参考基因组中，”Bhatt 说道，“不过我们可以采用从头组装基因组的方法，这将是一个令人兴奋的挑战。”这是一种可以从全基因组鸟枪法深度测序中获益的方法[1]。
③ 功能的挖掘
为了了解肠道微生物群落的功能，最终，我们需要确定哪些基因在表达并被翻译成蛋白质。因此，宏基因组数据越来越多地开始与 RNA 测序数据（宏转录组学）、分子分离方法、质谱或核磁共振手段结合，以建立微生物群落宏蛋白质组学和宏代谢组学的图谱。
波士顿哈佛大学公共卫生学院的计算微生物学家 Curtis Huttenhower 说：“更多的研究人员开始选择单独使用鸟枪法基因组测序或者结合其它方法，例如微生物代谢组学。将测序手段与高通量分子工具联系起来，使我们能够以全新的方式观察微生物群落。”
宏代谢组学分析可以通过识别肠道微生物代谢物与心血管疾病风险[2]或胰岛素敏感性[3]间的联系机制，帮助验证宏基因组学的发现。
Huttenhower 是人类微生物组生物活性资源库（HMBR）的项目负责人之一。该资源库提供平台和方法，并致力于整合 16S rRNA 测序、鸟枪法宏基因组测序、宏转录组测序和宏代谢组测序方法在微生物领域所取得的发现。HMBR 的目标是鉴定出对人类至关重要的微生物产物并确定它们的功能。
“我们正在努力地从数量惊人的未知基因、基因产物和代谢产物中，寻找出参与到疾病表型和受免疫活动或者节食行为调控的那一部分。”他说。事实上，人类肠道菌群中的 50%以上的基因都还是未知的[4]。
“我们需要相当长的一段时间才能完成这个鉴定工作。” Huttenhower 承认。
④ 学习如何操控肠道菌群
在过去的十年里，临床医生开始通过粪便移植方法，用一个“好的”微生物群替代“坏的”微生物群，进而修正病人的微生物生态系统。这似乎对一些疾病，尤其是复发性艰难梭菌感染，具有效果。但是，对于其他的肠胃疾病来说，效果如何，尚存疑虑[5]。
除此之外，微生物的作用和它们是如何被影响，更是扑朔迷离。某些肠道细菌与接受过造血干细胞移植的癌症患者的移植后感染有关[6,7]。“在接受干细胞治疗的患者中，大约有 40%的人会发生血液感染，通过追踪引发感染的病原体，我们最终将罪魁祸首锁定为肠道微生物。”Bhatt 说。
此外，当供体移植物的免疫细胞攻击受体的组织时，其发病率以及移植物抗宿主病的严重程度，都被认为和肠道菌群的变化（包括低微生物多样性）存在关联[8]。拥有多样的肠道微生物的生态系统有助于调节宿主炎症和免疫耐受。
Bhatt 的团队目前正在研究粪便移植和益生元是如何改变干细胞移植患者体内的菌群组成并改善他们的预后的。
不过，可能还有不需要替换整个微生物组的其他治疗方法。
去年，Bhatt 和她的同事们报告了成千上万的以前被忽视的，但可能在交流中起重要作用的小蛋白质（长度少于 50 个氨基酸），这种交流包括与其他微生物和宿主细胞间的交流[9]。进一步了解这些蛋白质的作用，可能会催生出更具针对性和潜在的更有效的治疗方法。
Huttenhower 的团队还在探究肠道生态系统（包括人体细胞和微生物）中的特定成分，他们需要对这些成分的功能进行深入的探究。“我们希望能够设计出精确针对正确的宿主免疫受体，或者抑制/激活正确的微生物代谢途径的小分子，以解决特定健康问题。”他说。
炎症性肠病（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）是 HMBR 的研究项目之一，现在研究人员通过计算就能够预测那些未被表征的胆汁酸和微生物蛋白在肠道炎症中的可能作用。
然后，他们可以利用微生物和哺乳动物的细胞或悉生小鼠（已知所具有的微生物或者无菌的小鼠），在受控的实验环境中确认这些化合物的活性并评估这些活性化合物在炎症性肠病发病机制中的作用[10]。
⑤ 前景和挑战
Bhatt 强调，为了改进肠道微生物组的功能分析手段，并开发出针对性的干预方法，在不同的时间点采集样本并进行测序，是非常必要的。
“微生物不是稳定的，也不是静止不动的，它们是有生命的有机体，并且在不同临床环境中表现出具有选择性的优势。” 她说。她还期待技术能进一步发展，以更准确地检查一个群落内的微生物基因组是如何随着时间变化的。
在微生物间的基因交换方面，目前也没有合适的检测方法。这种基因交换被称为基因水平转移，这是微生物适应不同环境的关键手段之一，例如转移抗生素基因。Bhatt 的团队正在尝试通过测序更长的 DNA 片段来克服检测上的问题，通过检测更长的片段，这些片段会更容易被拼接，从而可以获得更精确的细菌基因组的组装。
毫无疑问，第二代测序技术已经改变了宏基因组学领域。进一步发展分析方法，包括机器学习、整合微生物组数据，将对人类疾病产生深远影响。
“随着检测和分析微生物的工具越来越多，” Huttenhower 说，“可以提出的问题和潜在的转化应用，也会变得越来越多。
参考文献：
1.Hillmann,B., et al. mSystems 3:e00069-18 (2018)
2.Feng, Q.,et al. Sci Rep 6:22525 (2016)
3.Pedersen,H.K., et al. Nature 535(7612):376–381 (2016)
4.Joice, R.et al. Cell Metab 20(5): 731–741 (2014)
5.Holleran,G. et al. Drugs Today 54(2):123-136 (2018)
6.Ballen, K.et al. Biol Blood Marrow Transplant 22(9):1636-1645 (2016)
7.Tamburini,F.B., et al. Nat Med 24, 1809–1814 (2018)
8.Taur, Y.,et al. Blood 14; 124(7): 1174–1182 (2014)
9.Sberro,H., et al. Cell 178(5):1245–1259.e14 (2019)
10.Lloyd-Price,J., et al. Nature 569, 655–662 (2019)
原文链接：https://www.nature.com/articles/d42473-020-00214-9
编译｜朱国利
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